TCO – 四嗪连接 - Click Chemistry Tools

（图1）。 TCO–Tz 连接反应的示意图。

在低生物分子浓度（例如 800 M–1s–1)，这是任何其他生物正交连接对所无法比拟的。

反应性显然是在高度稀释条件下进行的应用的先决条件，例如蛋白质-蛋白质结合。由于蛋白质可用性有限和/或相关成本因素，蛋白质-蛋白质偶联通常限于低蛋白质浓度（例如 <1 mg/mL）。

反应性可以通过生物正交反应物对的二阶速率常数来定义。产物形成的二阶速率常数越高，在合理的时间范围内、在接近中性 pH 值且无需使用大量过量的任一生物分子的情况下，在低反应物浓度下的缀合越有效。 10 μM 生物正交反应物的二阶速率常数 (M–1s–1) 与结合物产率百分比随时间的关系如图 2 所示。

超快动力学、选择性和长期水稳定性的结合使 TCO–Tz 成为低浓度应用（如蛋白质-蛋白质偶联）的理想配对。

（图 2）。模拟 10 μM 反应物下的二阶反应

Example ApplicationFive 山羊 IgG 样品（100 μL，浓度为 5 mg/mL、4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL 和 1 mg/mL）在 BupH 缓冲液 (pH 7.5) 中进行标记使用 20 倍磨牙 exc四嗪-PEG5-NHS 酯的含量。同样，使用 20 倍摩尔过量的 TCO-PEG4-NHS 酯标记 BupH 缓冲液 (pH 7.5) 中 5.0 mg/mL 的 0.1 mL HRP (500 μg) 60 分钟。去除过量试剂并确定每种蛋白质浓度后，将 3 倍过量的 HRP-TCO 以 5 mg/mL、4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL 和 1 mg/mL 添加到 IgG-四嗪中。 60 分钟后，通过 SDS-PAGE 分析每个偶联反应的等分试样 (1 μL)。

（图 3）。在 10 μM 反应物下模拟二阶反应