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shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。
许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。
siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得
| 公司/组织 | 程序名称 | 描述 | 链接 |
|---|---|---|---|
| Thermo Scientific | siDESIGN | 方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域（5’或3’ UTR或ORF区），G/C百分比，可通过BLAST搜索序列。 | 链接 |
| Naito et al. | siDirect | 根据核苷酸序列识别目标，提供了序列内的位置，可供选择双链的熔解温度，脱靶序列的不匹配的最小数目。 | 链接 |
| Invitrogen | BLOCK-IT RNAi Designer | 在核算序列内识别siRNA, shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。 | 链接 |
| InvivoGen | siRNA Wizard | 可搜索一段编码序列作为siRNA序列，可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。 | 链接 |
| IDT | shRNA设计工具 | shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。 | 链接 |
| Gene Link | shRNA设计工具 | shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点，设计GC含量和长度。 | 链接 |
shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5'端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9 nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7 nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。 shRNA结构中5'端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。
多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶III U6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。
| 公司/机构 | 程序名称 | 他们能提供什么 | Link |
|---|---|---|---|
| The Broad Institute （可通过Sigma-Aldrich和Thermo-Fisher Scientific进入） | RNAi联营（TRC） | 通过公共-私人的努力，目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具 |
链接 链接到RNAi联营shRNA文库: 链接 |
| Sigma-Aldrich | 功能基因组&RNAi（与TRC协同） | 提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRC shRNA | 链接 |
| Thermo-Fisher Scientific | SMARTchoice, GIPZ, TRIPZ Inducible, 和TRC慢病毒shRNA选项 | 提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRC shRNA。 | 链接 |
为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（Scrambled Control）和非识别对照（Non-targeting Control）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。
对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。
| 公司/机构 | 描述 |
|---|---|
| Sigma-Aldrich | shRNA非识别对照 |
| 空载体对照 | |
| Thermo Scientific | shRNA阳性对照（识别eGFP） |
| 空载体对照 | |
| Invitrogen | 加扰siRNA对照 |
| 肌动蛋白, GAPDH, 或GFP阳性对照 |
确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。
转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。 质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。