Biosynthetic labeling - 实验方法

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分析表征方法的使用可确保蛋白质产品的同一性、纯度、结构和构象完整性以及活性。 Bio-Synthesis 在整个项目阶段提供许多常规蛋白质表征服务。这些方法也作为专用服务提供。如果需要，可以使用其他蛋白质表征方法。此外，可以对纯化的蛋白质采用专门的蛋白质表征方法。

请联系我们的蛋白质化学专家以满足您的蛋白质表征服务需求！

从原材料到最终蛋白质产品的蛋白质表征/分析cts

生物合成使用各种蛋白质表征技术对原始蛋白质、中间体和最终蛋白质产品进行分析。我们的蛋白质和抗体分析服务包括但不限于以下内容：

电泳（SDS-PAGE、native-PAGE、IEF-PAGE、尿素-PAGE）蛋白质印迹或斑点印迹通过光吸光度或荧光 ELISA 进行酶活性测定（直接或夹心）蛋白质测定（A280、BCA 或等效物）抗体同型分型内毒素测量（LAL 测定）污染 DNA 测定紫外-可见吸收光谱质谱

分离或鉴定蛋白质产品后，生物合成可帮助您分析蛋白质样品制备，以便使用以下平台进一步分析您的蛋白质

氨基酸分析 N 末端分析（Edman 蛋白质测序） 通过质谱法进行蛋白质鉴定和分析 消光系数测定 其他蛋白质表征服务 分析尺寸排阻色谱法（用于 n 的 SEC）分子量估计和聚集分析） 分析离子交换色谱（氧化或其他修饰） 紫外-可见光吸收光谱 氧化、降解和聚集产物分析 蛋白质去糖基化分析 通过免疫共沉淀、光谱、色谱或 ELISA 进行蛋白质/蛋白质相互作用 结合通过 ELISA 进行位点表征（n、Bmax、Kd、Hill 系数） 通过 ELISA 进行酶稳态动力学（Km 和 Vmmax） 抑制剂表征 - 抑制类型、IC50 和 Ki 测定相关服务：蛋白质基因工程和蛋白质表达蛋白质原材料生产蛋白质纯化服务检测和检测开发主页分子生物学 分子生物学产品 大肠杆菌蛋白质表达大肠杆菌蛋白表达系统 定制大肠杆菌蛋白表达服务

大肠杆菌表达系统是使用最广泛的重组蛋白表达系统。使用大肠杆菌进行蛋白质表达的优点是成本低、表达水平高、易于扩展且周转时间短。

服务亮点： 高效：我们收集了十余种宿主菌株和各种专有或非专有载体，保证选择最高效的表达系统。高生产率：多种融合标签和我们专有的 AIE 技术可在内部使用，以提高蛋白质的溶解度和产量，并降低纯化成本，即使是有毒蛋白质也是如此。重折叠：我们建立了一个有效的蛋白质重折叠系统，由 20 种重折叠缓冲液组成，并通过九个参数进行了优化，以增加获得可溶性和生物活性蛋白质的机会。 L大规模生产：我们能够生产高达 500L 的大肠杆菌细胞培养物，用于克级生产。修改：可使用稳定同位素（13C 和 15N）进行代谢标记和生物素化。有竞争力的定价我们的服务：克隆和表达 密码子优化和基因合成（可选） 将感兴趣的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体中 表达菌株的构建和表达条件的优化 中试规模表达和生产 2升细菌细胞培养物 用IPTG和IPTG诱导细胞收获细胞进行纯化 通过亲和柱、凝胶过滤、离子交换或疏水柱纯化带或不带标签的蛋白质 去除融合/纯化标签 5mg 的中试蛋白质生产 大规模生产 使用 60-80g 细胞进行高达 500L 的大规模发酵颗粒/升 高达克级的大规模纯化 其他服务 蛋白质重折叠 用稳定同位素（13C 和 15N）进行代谢标记 Biotinyla大规模发酵 大规模纯化 工艺开发

How long should cells be labeled?

The ideal length of time to label cells depends on the protein of interest and the label that you are using. If you want to label an unstable protein with 35S-methionine, a short labeling interval--no more than 2 hr--is best. If you are studying a stable protein, a longer label may be preferable. The issue is the half-life of the protein of interest relative to the half-life of the background bands. The half-life of total cellular protein is 45 to 50 hr.

Labeling with 32Pi is different.

In most cases, the phosphate in proteins undergoes continual turn-over. Therefore, both old and newly-synthesized proteins become labeled soon after 32Pi is added to the cells. A short labeling period with 32Pi is advantageous in that the labeling of RNA and DNA is less obvious than in cells labeled over-night. Additionally, for those of you studying tyrosine protein kinases, phosphotyrosines tend to turn-over faster than the bulk of either phosphoserine or phosphothreonine and thus are preferentially labeled during brief labeling.


If, however, you want to look at the steady-state abundance of phosphate in proteins, lipids, or RNA, an over-night labeling period may be the best. Under these conditions, you can be reasonably certain that the specific activity of the ATP pool in the cell and of the phosphates in macromolecules is beginning to approach that of the medium. Additionally, the amount of label present in proteins, lipids and RNA should now reflect the amount of phosphate present, rather than the rate of turn-over of the phosphate.


An issue to consider however is the fact that radiation damage can induce the stabilization of p53 and cause cell cycle arrest. Cells labeled for a prolonged period with 32P may therefore not be growing when you harvest them.

Many years ago, Mike Weber and Doc Edlin concluded that the specific activity of the ATP pool had come to equilibrium with the phosphate in the medium by 6 hours. There may therefore be no reason to label for longer with 32Pi.


Overnight labeling is best done in medium containing a reduced concentration of phosphate or methionine. 10% is often reasonable, depending on the cell line. This is easily accomplished by using methionine-free or phosphate-free medium and 10% undialyzed serum, which can be assumed to contain the same concentration of methionine or phosphate as normal medium.

For short term labeling--30 seconds to 5 hrs--

use (1) medium completely lacking either phosphate or methionine,
(2) serum which has been dialyzed against saline, and
(3) a fairly low volume of medium;

0.75 ml for a 35 mm dish, 2 to 2.5 ml for a 50 mm dish, and 2.5 to 5 ml for a 100 mm dish.

It is a good idea to rinse the cells you are going to label with labeling medium--which lacks label--prior to adding the actual labeling medium. Starvation doesn\'t help much.

 

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