CRISPR调控 Dharmacon厂家

CRISPRmod 是 CRISPR 激活和 CRISPR 干扰试剂的 Dharmacon 家族，用于靶向调节内源基因表达。

在分子生物学的中心法则中，DNA 是翻译为 RNA，然后翻译为蛋白质（图 1）。研究人员可以在多个点调节该途径通过功能丧失或获得功能实验来更好地了解基因功能。

现有的 CRISPR 敲除和 HDR 敲入技术允许研究人员编辑（进行可遗传的改变）细胞 DNA，而传统的 RNAi 技术会降解 mRNA ，从而阻止翻译。

CRISPRmod提供了一种新的基因调节方法，在转录水平上调节表达。 Dharmacon CRISPRmod 产品组合包括 CRISPRa 和 CRISPRi 系统，分别上调或下调靶基因表达。

两种 CRISPRmod 系统（CRISPRa 和 CRISPRi）都使用与任一系统融合的失活 Cas9 构建体激活子或阻遏子，以利用 PAM 锚定靶向的力量进行转录调节（图 2）。 CRISPRmod 只是将 CRISPR 的精确度带到了基因调节中。

RuvCI 和 HNH 核酸酶结构域中的点突变已经消除了天然 Cas9 DNA 切割功能（W. Cheng 等人），改变了 p将蛋白质转化为失活或死亡的 Cas9 (dCas9)。这种 dCas 蛋白经过进一步改造，通过将激活子或阻遏子结构域融合到 C 端来进行靶向转录调节。

图 2. 示意图显示 a) CRISPRa 机制结合 TSS 上游以激活转录b) CRISPRi 机制结合靶基因 TSS 下游以阻断转录。

CRISPRmod 能够实现新一代基于 CRISPR 的内源基因调控实验。 CRISPRmod 还提供了一种正交方法来确认从其他基因调节方法观察到的表型。

CRISPRmod 为同时调节多个基因提供了独特的方法多基因的调节。每个引导RNA独立地结合其特定的DNA靶标，并依赖于外源提供的dCas9融合蛋白，从而最大限度地减少对内源途径的竞争。在这里，我们展示了 iPSC 细胞内多重 CRISPRi 的有效性（图 3）。

图 3. 单个 CRISPRi sgRNA 可以汇集在单一试剂中以实现增强的靶基因抑制，也可以进行多重化以同时抑制多个基因。通过 Lonza 96 孔 Shuttle 系统，用靶向 PPIB、SEL1L 和 RAB11A 的合成 sgRNA 对稳定表达整合的 dCas9-SALL1-SDS3 的 WTC-11 人 iPS 细胞进行核转染。针对每个基因靶点选择最活跃的预先设计的 sgRNA，并单独使用或作为多靶点池的一部分，每个指南的浓度为 3 µM。 n后72小时收获细胞核转染，分离总RNA，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用 ACTB 作为管家基因，通过 ΔΔCq 方法计算每个靶基因的相对表达，并标准化为非靶向对照 (NTC)。三个基因同时受到抑制，而靶基因抑制没有显着降低，细胞活力和形态也没有显着变化。

经过验证的科学就是好的科学。 Dharmacon 试剂包括多种用于询问细胞通路的工具，可在 DNA 水平上灭活基因、调节 RNA 转录或降解成熟的 mRNA 转录物。我们随时帮助您选择适合您应用的最佳基因激活或失活方法。更好的是，选择两种方法来实现稳健、优雅、经过验证的科学。

CRISPRmod 为 RNAi 或 CRISPRko 筛选后的后续研究提供了理想的机会（图 4）。在这里，我们使用 CRISPRi 进行后续研究

图 4. 损伤反应测定。双链断裂周围的 h4AX（核心组蛋白复合物的组成部分）迅速磷酸化，通过 DNA 损伤信号网络产生一系列反应。对 DNA 损伤途径至关重要的蛋白质的敲低会导致未修复的双链 DNA 断裂的积累，以及磷酸化 h4AX (γ-h4AX) 的增加。来自 p 的点击次数使用 CRISPRi 试剂对现有的 RNAi 筛选进行正交验证。使用 DharmaFECT 4 转染试剂，用针对 RPA2、RPA1 或 RRM2 的汇集 sgRNA (50nM) 或 ON-TARGETplus SMARTpools (50nM) 转染在 hEF1α 启动子下组成型表达 dCas9-SALL1-SDS3 的 U2OS 细胞。转染后72小时，固定细胞并用抗磷酸-h4AX抗体染色，并使用Hoechst染色来鉴定细胞核。收获重复板，分离总RNA，并使用RT-qPCR测量相对基因表达。使用GAPDH作为管家基因，通过ΔΔCq方法计算每个靶基因的相对表达量，并标准化为非靶向对照（NTC）。

我们为转录和转录提供CRISPRmod试剂系统抑制 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa)。这包括一整套合成指南和 mRNA 选项，可轻松实现电穿孔/转染和快速获得结果，以及借用用于难以转染细胞或延长时程实验的病毒选择。请参阅下面的产品页面或联系我们的专家科学支持团队，找到最适合您需求的产品形式。

CRISPRi实验条件多种选择，探索试剂

多种选择对于 CRISPRa 实验条件，探索试剂。

用于功能丧失实验的 CRISPRi 控制

使用 Horizo​​n CRISPRa 或 CRISPRi 的出版物

用于基因过表达和下调的 CRISPR-Cas9