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| Q：慢病毒对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？A：首先要保证细胞在感染之前处于良好的生长状态，提前24小时在细胞板上铺好细胞。其次可以使用易感细胞如293T进行滴度测试，检测慢病毒浓缩液滴度是否出现大幅下降。在此基础上适当提高慢病毒感染的MOI值和延长感染时间。另外，还可以选择在培养基中添加polybrene或更换为FItransfer培养基。Q：加入慢病毒后，目的细胞状态很差或出现大量死亡，原因是什么？如何解决？A：无论是用真核表达质粒转染还是用慢病毒感染，在引入宿主细胞时均可能引发细胞的毒性反应，如果所选择的宿主细胞系对慢病毒感染很敏感，则会出现严重的生理异常或死亡。针对这种情况有以下几点解决方法：首先要在感染之前保证细胞处于良好的生长状态；二是要适当降低感染的MOI值，以降低细胞的毒性反应；三是要根据细胞反应，在感染后4~12h为细胞换液，并观察细胞的反应。Q：如何评估慢病毒的感染效率呢？A：我们构建的慢病毒载体常常带有荧光标记基因（如GFP等），因此可在感染后3~4天后观察到荧光，可以用显微镜观察或流式细胞仪检测阳性细胞的数量；另外，还可以利用Real-time PCR检测宿主细胞中的慢病毒载体拷贝数，以评估慢病毒的感染效率。Q：如何确定选择的宿主细胞能否被慢病毒感染?A：由于慢病毒是一种经过改造的特殊逆转录病毒，它的感染谱很广，分裂细胞和非分裂的细胞均可以被感染。因此在实验前应该先查找相关文献，了解慢病毒感染这种宿主细胞的大致条件；但是由于很多细胞系并没有这方面的研究基础，因此在正式实验之前需要进行慢病毒感染预实验，即用空的带荧光标记的慢病毒来感染选定的宿主细胞，根据细胞是否可观察到荧光，来判断外源基因是否已经在宿主细胞内表达了。辉骏生物可针对这部分客户的需要，会为定制“慢病毒稳定株建立”服务的客户免费进行预实验，以解除您的后顾之忧。Q：稳定细胞株筛选的药物浓度如何确定？A：在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。对于一些常见的细胞系，通常可以在文献等资料中找到推荐的药物浓度。用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。不同批次的药物活性有一定差异。因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。 广州辉骏生物科技拥有一支经验丰富、优秀刻苦的蛋白质组学实验技术队伍，自2008年成立以来，已成功为各地科研单位完成了超过3000张双向凝胶电泳，以及20000个以上的蛋白质质谱分析鉴定。本公司在蛋白质组学、分子生物学、病毒包装等实验拥有深厚的经验积累，服务项目包括样本制备、双向电泳、图像分析、胶内酶切、蛋白质鉴定、质谱分析、数据库查询与结果分析、免疫印迹及磷酸化蛋白质检测。更多实验请联系我们企业QQ：4006991663电话：400-699-1663 / 020-32053431邮箱：service@fitGEne.com 官网：www.fitgene.com丁香通：https://fitgene.biomart.cn地址：广州市萝岗区科学城广州国际企业孵化器D506 |
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