Genemay>>> IHC对冷冻组织切片的染色
1.将新鲜的组织小心地放在塑料模具中的OCT中,注意不要夹住组织周围的气泡。通过将模具放在液氮顶部冷冻组织,直到块的70-80%变白。然后,将块放在干冰上。冻结的块可以在-80 o C下 进行长期存储。
2.对于切割步骤,将冷冻的块安装在低温恒温器支架上。从来,在任何点,让组织升温至温度高于零下15 ö Ç。
3.让冷冻的块在低温恒温器室内平衡约5分钟。切开6-10mm的部分。当块温度是大约零下18至零下20最好部分通常获得Ò Ç。
4.在室温下将切片干燥至少30分钟。注意:干燥后,薄纸可以在4 o C下保存几天;如果要长期保存长达几个月,请在-80 o C下保存。
5.在室温下浸入丙酮罐中1-2分钟以固定切片,然后风干。使用PAP笔仔细绘制部分的边界,并使其干燥几分钟。
6.将一抗(在0.05M Tris-盐水中稀释,pH 7.4,2.5%血清)直接添加到切片上。加入大滴以一次覆盖整个组织,以防止由于溶液的表面张力而导致切片破裂。在室温下于培养箱中孵育至少一小时。注意:将切片用Tris-saline重新补水后,切勿再次使组织变干(这会破坏组织结构)。
7.在Tris-盐水中轻轻冲洗切片3-5分钟,然后在Tris-盐水/2.5%血清中再次冲洗3-5分钟。
一种。如果使用生物素化的一抗,请跳过以下两个步骤(8和9),然后转到步骤10
。如果使用纯化的第一抗体,则继续步骤8的操作
。8.在不让切片变干的情况下,添加稀释于Tris-saline / 2.5%血清中的第二抗体。像以前一样孵育至少45分钟。
9.按照步骤7所述进行洗涤
。10.用约100 µl稀释的SA-AP或SA-HRP盖上玻片。在室温下孵育30分钟。
11.按照步骤7所述进行清洗
。12.染色玻片。
一种。对于HRP,请与AEC底物一起孵育:每1ml 0.17 M NaOAc,pH 5.2加1µl H 2 0 2需加25µl AEC储备液(在DMSO中为4mg / ml)。孵育20-30分钟。
b。对于AP,与AP底物一起孵育:在Tris-Saline pH 8.5中将Fast Violet(最终1mg / ml)+ Napthol AS-MX磷酸盐(最终0.2mg / ml,来自DMSO中的10mg / ml)在Tris-Saline pH 8.5中孵育10-20分钟,直到达到所需的阳性染色。
13.用Tris-盐水冲洗2次。
14.用Mayer /苏木精复染30秒,然后用自来水清洗2-5分钟。
15.用固定介质固定盖玻片。
16.阅读幻灯片。