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PEG修饰蛋白分离纯化中应注意问题除了riboenzyme中谈到的问题，还要注意所用PEG修饰剂种类，即使都采用琥珀酰亚胺类的修饰剂，由于修饰反应后，残留PEG带电不同，也要选择不同填料。如果用mPEG－SC修饰，由于反应后是游离mPEG－OH，所以采用阴离子交换或阳离子交换，mPEG－OH都直接穿透，当然如果你采用glysine封闭未反应修饰剂，那麽mPEG－gly采用sp柱穿透，但如果用DEAE可就不是穿透了。用mPEG－SPA的化，水解产物是mPEG丙酸，如果用醛基修饰，采用氨基乙醇封闭，可以是中性所以在分离纯化时一定要考虑所用PEG修饰剂种类
riboenzyme 国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈最近做了个实验,如果采用lowry法测定,mPEG-OH会干扰测定,引起沉淀.各位也可以试一下,lowry试剂+mPEG会产生沉淀,所以如果残存PEG太多,会影响lowry法测定蛋白浓度结果
展开引用riboenzyme 这一篇主要是讲PEG修饰条件影响PEG修饰蛋白的反应条件一般有修饰剂用量、反应pH值、反应时间、反应温度等，某些种类的PEG需要加入其它试剂（如mPEG-ALD需加入硼氢氰化钠）时，也应考虑所加试剂的反应条件。修饰剂用量：PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点。就应pH值：PEG衍生物在不同的pH值条件下反应活性和修饰位点有明显差异，亲电性的琥珀酰亚胺在碱性环境下反应活性较高，主要与赖氨酸残基的E氨基反应，而在酸性环境下反应活性较低，主要与组氨酸的咪唑基反应。虽然先灵葆雅公司采用pH6.5的反应条件制备PEG修饰的干扰素PEG Intron A，但从修饰效率考虑，大多数亲电性PEG衍生物采用碱性条件反应。反应时间：不同的PEG衍生物和不同的蛋白最佳反应时间各不相同反应温度：一般为保留蛋白活性多采用低温条件。......不过千万不要把你的NHS活化修饰剂溶解在你的高pHbuffer中，否则你可能得到依然是你未修饰蛋白，因为修饰剂已完全水解。如果你需要溶解PEG修饰剂的话，要溶解在酸性溶液中比如1mM HCl中，然后加入到蛋白溶液中
好!!!!!好帖!!!!!!!要多支持!!!!!!和想和大家分享快乐!!!
聚乙二醇修饰反应类型在20种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰。常用的反应氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和C-端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性，其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>alpha氨基>E氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。根据化学修饰剂与蛋白质之间反应性质的不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型，对蛋白质进行氨基、巯基和羧基等侧链基团进行化学修饰。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上，而羧基如果不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和反应，也很难活化。因此，蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基，包括alpha氨基或E氨基。氨基修饰蛋白质分子表面的游离氨基具有较高的亲核反应活性，一般不处于活性中心部位，因而成为化学修饰中最常用的被修饰基团。主要修饰氨基是赖氨酸的e-、alpha-氨基和末端氨基。游离氨基在蛋白质分子中含量较高，亲电性活化聚乙二醇和氨基酸的游离氨基反应时，多为随机修饰，常有几个氨基被修饰，导致多态混合物的产生，即使只结合一个聚乙二醇，也可能结合在不同的氨基位点上，产生位点异构体。由于蛋白质只有一个末端氨基，因此对它的修饰可以减少多态混合物和位点异构体的产生，但修饰末端氨基的聚乙二醇反应时需使用硼氢氰化钠，有一定的毒性。氨基修饰最常用的修饰剂为SS-PEG、SC-PEG、SPA-PEG、NHS-PEG2和ALD-PEG等。巯基修饰活化半胱氨酸的巯基往往处于蛋白质的活性中心部位，位于蛋白质表面的自由巯基远少于氨基，因此修饰效率低下，修饰后蛋白活性损失较大，但其优点是修饰专一性高于氨基修饰。若天然蛋白中不含半胱氨酸，则可通过基因工程改造方法在蛋白的特定区域引入一个或一个以上的自由半胱氨酸，对蛋白质进行定点修饰，从而使生物活性损失最小化，但也可能导致蛋白形成二聚或多聚体。最常用的修饰剂为MAL-PEG。羧基修饰羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先将聚乙二醇分子中的羧基转化为氨基，再在羧二亚胺存在的条件下与蛋白质的羧基结合，但同时也易产生其它的交联反应。目前使用较少。
PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。
支持！学习中！以前没有注意过这方面内容，请教：这个主要的应用领域，是否是在药物代谢方面？
谢谢推荐，愿听lz更深入的分析，学习中！
GEHealthcare PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。愿问其详，GEHealthcare战友能否把这种方法详细说明，若能一步层析就可以拿到单点修饰的PEG产物，下面我要讲的PEG产物纯化就要改改了。三年前我做PEG产物纯化的时候试过分子筛，疏水，离子交换，最后还是离子交换解决了问题，但在区分单点和多点修饰产物上还是花费了很多时间。谢谢
SmallDonkey 支持！学习中！以前没有注意过这方面内容，请教：这个主要的应用领域，是否是在药物代谢方面？一语中第，PEG修饰的目的就是改善蛋白药物（尤其是小蛋白药物）在体内的抗原性、半衰期，长效干扰素、长效胰岛素等药物出现，不但改良了药效，而且由于体内半衰期延长，减少病人打针的次数，方便病人并降低了痛苦
聚乙二醇衍生物的分类聚乙二醇末端的羟基是其在化学修饰反应中的功能基团，但它的反应活性较低，只有在较为强烈的条件下才能与其它基团反应，而这样的条件通常是蛋白质无法耐受的，因此必须先对聚乙二醇进行活化，使其在温和的反应条件下以高反应速率与蛋白质偶联。根据活化方式、电性、结构和端基等的不同，聚乙二醇衍生物可有不同的分类方法。按活化方式的分类按照活化方式的不同分为同端基遥爪聚乙二醇和异端基遥爪聚乙二醇。将聚乙二醇两端的羟基用不同的基团取代，得到异端基遥爪聚乙二醇，如果两端的取代基团均为活性基团，则称为异端双功能基遥爪聚乙二醇，如果两个取代基团中一个为不活泼或者惰性基团，另外一个为活泼基团，则称为异端单功能基遥爪聚乙二醇。由于聚乙二醇两端同时活化不但要消耗较多的活化试剂，而且在化学修饰过程中容易发生蛋白交联，有些情况下还不得不加入其它化合物来阻止或抑制交联反应的发生，所以同端基遥爪聚乙二醇目前已经很少使用。异端双功能基遥爪聚乙二醇较难合成，并且在用于化学修饰时也会象同端基遥爪聚二醇那样发生不期望的交联反应，因此实际应用也较少。相比之下，异端单功能基遥爪聚乙二醇由于容易合成，很少或不发生交联反应而得到了广泛的应用。通常采用一端羟基被甲基封闭，不能参与反应的单甲氧基聚乙二醇（mPEG）进行活化，通用分子式为：CH3O–(CH2–CH2O)n–CH2–CH2–OH按端基的电性分类根据端基电性的不同，聚乙二醇衍生物可以分为亲电和亲核两大类。亲电类聚乙二醇衍生物比较常用，种类也很多，如琥珀酰亚胺琥珀酸酯聚乙二醇(PEG Succinimidyl Succinate, SS-PEG), 苯并三唑甲酯聚乙二醇（PEG Benzotriazole carbonate, BTC-PEG），琥珀酰亚胺丙酸酯聚乙二醇（PEG Succinimidyl Propionnate, SPA-PEG），琥珀酰亚胺二聚乙二醇 (PEG2 Succinimide, NHS -PEG2)，醛类聚乙二醇（PEG Aldehyde,ALD-PEG）、N,N’-羰基二咪唑聚乙二醇（PEG Oxycarbonyl imidazole,CDI-PEG ）等。亲核类聚乙二醇衍生物有聚乙二醇胺类衍生物（PEG-O-CH2CH2-NH2, PEG-NH2）、马来酰亚胺聚乙二醇（PEG Maleimide, MAL-PEG）等。按发展历史分类根据发展历史可分为第一代和第二代聚乙二醇。第一代聚乙二醇局限于应用低分子量的mPEG(<20000Da)。常用的修饰剂有SS-PEG、琥珀酰亚胺甲酸酯聚乙二醇（PEG Sucinimidyl Carbonate, SC-PEG）等，其中大部分通过酰基化反应修饰蛋白质。第一代PEG修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性，生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。第二代聚乙二醇分子量可大于20000Da，在二醇污染、稳定性、活性保留、专一性等方面均优于第一代聚乙二醇，常用的修饰剂有SPA-PEG、BTC-PEG、NHS-PEG2、ALD-PEG、MAL-PEG等。
GEHealthcare PEGylate 后的修饰物的分离也曾是一个难点，但现在已经可以通过一步层析，将单点修饰的PEG蛋白与未修饰蛋白及多点修饰蛋白分开。如果是自身的二聚体或多聚体，使用经典的分子筛就可解决问题了。我想你应该是GE公司的吧，你应该没有怎么做过这个实验实际上也没有你说的那么简单吧（但还是想了解你们这个填料的信息，好象比较贵）GE公司的那个专门分离纯化PEG-Protein的填料不是每个蛋白的效果有这么好也许就是一两个能达到这样的效果吧我想要分离纯化比较理想的单位点PEG修饰蛋白还是要用离子交换和反相比较实用点，当然离子交换要比反相好，但主要是有时候小分子的蛋白PEG修饰后离子交换挂不上，反相分离度高，但最后要除酒精，也容易使蛋白变性，而且我感觉重复性不高，不知道为什么！对于用分子筛不好扩大。现在正在为这个有点愁！！！！！！还想请楼主多指点。
展开引用vicardin 我想你应该是GE公司的吧，你应该没有怎么做过这个实验实际上也没有你说的那么简单吧（但还是想了解你们这个填料的信息，好象比较贵）GE公司的那个专门分离纯化PEG-Protein的填料不是每个蛋白的效果有这么好也许就是一两个能达到这样的效果吧我想要分离纯化比较理想的单位点PEG修饰蛋白还是要用离子交换和反相比较实用点，当然离子交换要比反相好，但主要是有时候小分子的蛋白PEG修饰后离子交换挂不上，反相分离度高，但最后要除酒精，也容易使蛋白变性，而且我感觉重复性不高，不知道为什么！对于用分子筛不好扩大。现在正在为这个有点愁！！！！！！还想请楼主多指点。......我现在还不了解GE介质的信息，迫切希望GEHealthcare战友能贴出来vicardin战友的问题也是我当时摸索条件的时候碰到的问题:)PEG修饰产物纯化难主要是由于PEG分子在水溶液中具有伸展的构象，其流体动力学体积远远大于同样分子量的球状蛋白质，使得球状蛋白质与PEG的分离非常困难虽然有人用SEC分离出PEG修饰的单点产物，但这只是个别情况，因为PEG线性分子并不像蛋白质的球形，PEG在SEC中运行的轨迹很复杂，不想蛋白质那么简单，这点从PEG的SDS-PAGE电泳也能看出来，在SDS——PAGE电泳上表现得是很糊的一片，光从这个角度来看，SEC是不适合分离PEG话的蛋白的，何况还有多点，单点和未修饰蛋白表观分子量差别情况反相虽然分离度高，但缺点正如vicardin所说，用反相分离无活性的小肽倒是可能，但分离活性蛋白不是很好我推荐用离子交换，我们做过好几种蛋白，不论是碱性蛋白还是酸性蛋白，用离子交换一步就能得到纯品，现在很多活化的PEG都是修饰氨基，氨基在蛋白质中是带正电的，PEG修饰后会出现正电荷减少的情况，另外还有PEG的封闭作用，使得PEG修饰的蛋白等电点都靠近中性。基于这些情况，选用阳离子交换柱是比较好的选择，但不全按照离子交换的原理来进行的，在后面的纯化一章会说明
这一篇主要是讲PEG修饰条件影响PEG修饰蛋白的反应条件一般有修饰剂用量、反应pH值、反应时间、反应温度等，某些种类的PEG需要加入其它试剂（如mPEG-ALD需加入硼氢氰化钠）时，也应考虑所加试剂的反应条件。修饰剂用量：PEG用量越大，修饰率和修饰多态性越高，一般增加PEG分子量可延长药物的循环半衰期，但除个别蛋白的PEG修饰对蛋白质活性影响不大外，大多数蛋白质的活性随着修饰PEG数目和分子量的增加而降低，因此在修饰率、修饰多态性、活性保留率和成本之间需寻求平衡点。就应pH值：PEG衍生物在不同的pH值条件下反应活性和修饰位点有明显差异，亲电性的琥珀酰亚胺在碱性环境下反应活性较高，主要与赖氨酸残基的E氨基反应，而在酸性环境下反应活性较低，主要与组氨酸的咪唑基反应。虽然先灵葆雅公司采用pH6.5的反应条件制备PEG修饰的干扰素PEG Intron A，但从修饰效率考虑，大多数亲电性PEG衍生物采用碱性条件反应。反应时间：不同的PEG衍生物和不同的蛋白最佳反应时间各不相同反应温度：一般为保留蛋白活性多采用低温条件。
首先感谢riboenzyme老师在这里开了这个专题，给了大家一个交流的平台和机会，也希望大家能踊跃出来说说话把自己实验中遇到的问题说说也许这里能为你指点小道我相信riboenzyme是在这个行业非常有经验的老师有很多话要说可是现在时间计较紧网络不是很方便等晚上有时间回去好好来这里写写自己的一些感受也希望大家一起来交流一下特别像riboenzyme老师一样的人希望主要说一下实验中的操作问题至于理论的东西还是可以看看书了解
呵呵，说得也是，前面主要是些理论，PEG难点是纯化，接下来我会把电泳分析,柱分析的图片贴上，我在看怎么可以直接贴图片，我还不会:)
参考附件。（由于上传文件大小限制，删除了第三页的部分图片，抱歉！）如楼上所说，任何一个技术都不可能解决所有问题，文中的分离也只是一个较理想的例子，但不失为一个可以尝试的新方法。如果不违反此坛的规则，我可以提供免费样品，各位可以试试自己的样品的分离效果。也可在此交流试用后的效果，不管是满意的还是不满意的。Pages from 28-4005-84_web150.pdf(252.21k)
可以自己下载参考文献：http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3AMacroCap+SP%28327299504-D525%29?OpenDocument&hometitle=searchhttp://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3AOptimization+of%28336661211-D525%29?OpenDocument&hometitle=searchhttp://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/WD%3ALiving+large+-+%28340092199-J450%29?OpenDocument&hometitle=search
展开引用vicardin 首先感谢riboenzyme老师在这里开了这个专题，给了大家一个交流的平台和机会，也希望大家能踊跃出来说说话把自己实验中遇到的问题说说也许这里能为你指点小道我相信riboenzyme是在这个行业非常有经验的老师有很多话要说可是现在时间计较紧网络不是很方便等晚上有时间回去好好来这里写写自己的一些感受也希望大家一起来交流一下特别像riboenzyme老师一样的人希望主要说一下实验中的操作问题至于理论的东西还是可以看看书了解......非常欢迎Vicardin战友在这里讨论，开这个专题的目的也是这个，同时也希望大家把自己的经验介绍给更多的战友
展开引用GEHealthcare 参考附件。（由于上传文件大小限制，删除了第三页的部分图片，抱歉！）如楼上所说，任何一个技术都不可能解决所有问题，文中的分离也只是一个较理想的例子，但不失为一个可以尝试的新方法。如果不违反此坛的规则，我可以提供免费样品，各位可以试试自己的样品的分离效果。也可在此交流试用后的效果，不管是满意的还是不满意的。......感谢GEHealthcare战友提供的资料，我仔细看了下，也是离子交换原理，和下面介绍的内容差不多。我在做离子交换也用过SP，但分离效果没有这篇文章说得那么好
PEG修饰产物的分离纯化方法沉淀法蛋白质在一定浓度的盐溶液或有机溶剂中会发生沉淀，而PEG由于其两亲性则继续保持溶解状态，通过简单的离心就能将蛋白质与PEG分离开来。唐微等采用硫酸氨沉淀法可将rIL-2和PEG完全分离开。膜过滤法透析膜或超滤膜上具有一定孔径大小的微孔，若在膜中加入不同分子量的混合物，则小于孔径的分子会透过膜，而大分子则留在原处。由于分辨率低，一般仅用其除去修饰混合物中的游离PEG或浓缩分离产物超滤法适合于分离产物的浓缩和换液，与沉淀法相比活性损失小，无需脱盐，但缺点是成本较高，易吸附蛋白。凝胶过滤层析法凝胶过滤层析的分离原理是分离颗粒介质中具有大量孔径均一的网状孔道。分离样品中的小分子物质可以进入颗粒内部，所经历的路程较长，因此流出时间较长，后出峰；大分子物质从颗粒外通过，因此先出峰，据此可以分离不同分子量的物质。PEG修饰蛋白质的分子量大于天然蛋白质，因此出峰较天然蛋白质早，PEG偶联越多，修饰蛋白质出峰越早。McGoff等用GF柱分离PEG修饰SOD，可将未修饰、单点、两点修饰SOD分开。离子交换层析法离子交换层析在分离纯化蛋白质的层析手段中使用最广泛，其分离原理是离子交换树脂结合带有大量电荷的侧链，当溶液pH偏离等电点时，蛋白质就会带电荷，若所带电荷与离子交换树脂侧链电荷相反，蛋白质就可与之结合，结合的蛋白质可根据结合力的不同用不同浓度的盐离子洗脱，从而达到分离纯化效果。影响PEG修饰蛋白质带电荷数的因素目前认为有两个，一方面大多数PEG修饰的位点是蛋白质表面的游离氨基，由于氨基在酸性和中性环境下结合氢质子而带正电荷，PEG修饰蛋白质后这些氨基失去与氢质子结合能力，蛋白质的正电荷数会减少，等电点偏酸。另一方面PEG自身不带电荷，当PEG覆盖于蛋白质表面时可能会阻碍蛋白质与离子交换树脂侧链的结合，从而导致修饰蛋白质的洗脱盐浓度比天然蛋白质低。采用离子交换层析分离PEG修饰蛋白质的最大优势在于PEG不带电荷保证了它不会吸附于柱上，因而可以很方便的将PEG与蛋白质分开。刘丽军等用CM Sepharose FF分离PEG修饰的rhIFN-2b，洗脱峰依次为未结合的PEG、多点修饰产物、单点修饰产物和未修饰的rhIFN-2b。根据结果分析PEG修饰蛋白质在离子交换层析中主要受PEG屏蔽作用影响，无论是用阴离子还是阳离子交换层析，蛋白上偶联PEG个数越多，结合力越弱，出峰越早；其次受氨基修饰的影响，由于阴离子交换树脂结合的主要是蛋白质的羧基，受氨基修饰影响较小，因而分离效果不如阳离子交换树脂。离子交换层析时缓冲液pH值至少应与蛋白质等电点相差一个单位，修饰样品应用缓冲液或水稀释以降低样品的离子强度。疏水层析和反相色谱法疏水层析和反相层析的原理是分离介质带有疏水侧链，蛋白质在高盐浓度溶液或有机溶剂中变性，暴露出疏水部位，与分离介质结合，降低盐浓度或有机溶剂浓度可将其洗脱下来。PEG具有两亲性，但与蛋白质相比疏水性更强，因此PEG修饰蛋白质的疏水性强于天然蛋白，与分离介质的结合力更强，较天然蛋白晚出峰。Katre等采用疏水层析的梯度洗脱法成功将rIL-2与PEG-rIL-2分开。反相层析由于使用有机溶剂作为流动相，导致蛋白质失活，一般用来分析而不是分离活性蛋白。到此整个PEG修饰纯化的理论就结束了，接下来是实验了，热烈欢迎大家讨论
A蛋白PEG修饰纯化，已经开始大量生产
B蛋白修饰纯化，实验室规模希望大家对这两个不同蛋白的纯化过程进行讨论
我觉得单点和多修饰很难彻底分开
riboenzyme战友：B蛋白的修饰率比较低
主要是单点和多点性质相近而难以分离，这时候就要求对离子交换的盐离子梯度进行调整。B蛋白的修饰率可以很高，但多点修饰也多，所以我必须选择单点修饰最多的条件，因为B蛋白自产，所以不需要考虑太多成本:)
我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵:)
riboenzyme老师:我想问你几点1 我想问一下你们的PEG是哪个公司的2 为什么两个蛋白都是用20000的PEG修饰?(A蛋白用20000的还勉强,但B蛋白就不是很理想哦)3 我看你的B蛋白的第5条带，就算是单个的PEG修饰的，那也未必就都是在蛋白的一个位点修饰的啊，你这个是怎么处置的？？？？？？？4 你 电泳是用的什么胶？？？（效果还不错，PEG的影响不大，与普通的SDS-PAGE有什么改进的吗？）5 你们最后的蛋白是用什么方法定蛋白浓度的??6 如果你们用的是BCA /LOWRY 、、的话PEG有没有影响测定？？呵呵 在说几点看法：A蛋白做的修饰和分离效果都比较好，就是不知道最后有没有达到你要蛋白改变的目的，我建议你要是用个30000的双连的就会比较好。要说B蛋白用的PEG就更小了（但单点修饰率还是比较高），最后改变的效果就更不明显了，要是用个40000的双链的就最好了，还有那后面两个峰的分离度不够高，这样以后用于大生产的话上样量就会很小，会加大很多生产成本，我建议你后面用阶梯剃度洗的话分离效果可能会好点，这样也比较好扩大生产。:D:D:D:D:D:D
你的问题非常好1：以前用得都是Nektar的，现在国产的也有了，效果也还可以，国内的厂家你可以在DXY查查2：这两个蛋白都用过很多修饰剂做得，SPA5000，NHS10000 SPA20000等，发现SPA20000反应活性较高就采用SPA20000做得3：单点修饰并不是同一个点修饰，单点在不同的点也有可能，但通常蛋白上总有一个氨基活性是最高的，修饰的可能性也最大，如果你要确定那个点进行了修饰，可能要对修饰蛋白进行酶解后分析了4：常规胶，200V到底，也有电泳不好看的，呵呵。上面是纯化后的，PEG的浓度较低，照片也好看些，B蛋白那张图片有个修饰混合物，里面有很多未修饰PEG，就不是很好，后面我会贴出很多难看的，PEG确实会影响电泳结果的5：Lowry方法测得，与OD280结果做过对照，差不多 6：你可以在BAC里看看PEG的影响，我们在Lowry里没有发现
其实不一定要PEG完全包住，这需要多者之间找到平衡点，PEG修饰后，蛋白活性肯定下降，但在血浆中保留性，稳定性，时效性有所上升，若有可能需要多加比较，从而找到平衡点
展开引用zhouyindi 我想从血清中纯化IgG蛋白，先用硫酸铵沉淀，然后再透析，最后想再过一个ProteinA蛋白的柱子，可是硫酸铵沉淀的饱和度我没有摸索，直接从师姐那里抄的步骤，我今天才知道沉淀用的硫酸铵是要摸条件的，可是我用了饱和度为50，和33的，然后全部丢弃了上清，不知道结果会怎么样？在我过柱子前，我还需要把透析的蛋白做那些处理较好？谢谢大家帮忙。我看在这里讨论的都是高手，就把我这个暂时和PEG纯化无关的问题拿来问了，呵呵:)......IgG的纯化我也做过一点，但印象不是很深刻。我记得有两个硫酸铵浓度的，开始是去除血清白蛋白，然后是沉淀IgG，我回去查查以前的记录，晚上贴出来
A蛋白多种修饰剂反应
感谢riboenzyme 老师也希望更多的战友一起来讨论1、PEG试剂我倒是国产和进口的都用过，做过对照，国产的有凯正和健凯的，都要比进口的差点，不知道你用哪家的。2、我用过LOWRY测过，但有很多的絮状沉淀，用BCA到是没有，但就不知道准不准。
国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈
riboenzyme A蛋白多种修饰剂反应呵呵，从这张图上看10000的修饰效果更好啊，但 可能后面的药效不是很理想吧，是不是这样啊riboenzyme??
riboenzyme 国产的我没有用过，絮状沉淀是不是因为蛋白浓度高了？你是蛋白是纯化后测得么？我们这里好像没有出现这种情况可能PEG修饰的热度过了，现在讨论的比较少，等我把PEG整个过程做完，我们开始抢Chromatography的生意，做蛋白纯化问题解答，哈哈没有，蛋白的浓度很低的，做过比较，只有含PEG的才有沉淀物，且只在LOWRY中有。呵呵强GE的生意，呵呵呵呵、、、、那也只能抢PEG-Protein分离这一快的吧。但从精神上我强烈的支持你，现在GE公司的产品价格高的离谱
你是测纯化的PEG修饰产物的浓度么？ 那出现絮状沉淀就很奇怪了，我们一直都是用Lowry测得，这么经典的方法我就不贴出来了GE产品都是美金报价，有关系你可以拿到比较便宜的价格的