cDNA文库的载体制备

1．pBlueScriptII的提取1．取1ul商品的pBlueScriptII，转化入大肠杆菌宿主菌中，取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上，37℃培养过夜。2．第二天取一只无菌的50ml离心管，加入10ml AMP抗性的LB液体培养基，挑单克隆于离心管中，37℃，250rpm，培养过夜。3．第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养6 hr左右，使OD值达到0.6-0.8。4．将菌液移入250ml离心管中， 4℃，3000rpm，离心15min。取出离心管，菌团朝上倒掉上清，将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。（注意离心前需配平）5．加入10ml溶液Ⅰ（50mM Glucose ， 25mM Tris-HCl，10mM EDTA， pH8．0），加入RNase至终浓度100µg/ml，晃动摇菌，使菌体充分悬浮，静置10min。6．按NaOH（0.4N）：SDS（2%）--1：1的比例新鲜配制溶液Ⅱ，加入20ml溶液Ⅱ，静置3-5min。注： 静置时间勿超过5min，提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。7．加入15ml冰浴的溶液Ⅲ，冰浴15-30min。8．4℃，5000rpm，离心15min。9．取上清于两个50ml离心管中，弃去原离心管中的沉淀。10．每管加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀，室温下放置10min。11. 20℃，12000g，离心20min回收质粒沉淀。12．弃上清，用70%的乙醇洗2次。13．弃上清，倒扣于吸水纸上，尽量空干液体。14．用3ml TE（pH8.0）溶解沉淀，移入1.5ml Eppendorf离心管中。15．电泳检查DNA质量并定量。（必要的话，可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。）2．pBlueScriptII的双酶切消化1．以如下体系进行EcoRI酶切：pBSK(+) X µl（6µg）ddH2O 174-X µl10×Buffer E 20 µl混匀，加入限制性内切酶：EcoRI （10U/ µl） 6 µl总体积为200 µl。2．轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。3．37℃，水浴1hr。4．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。4℃，13000rpm，离心15min。5．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。6．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。7. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。8．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。9．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。10．自然风干沉淀，至无乙醇味，加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。11．加入以下试剂进行XhoI酶切：ddH2O 74 µl10×Buffer D 20 µl混匀，加入限制性内切酶XhoI：XhoI （10U/ µl） 6 µl总体积为200 µl。12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下13.37℃，水浴1.5hr。14．加入200ul 1:1的酚/氯仿，混匀。15．4℃，13000rpm，离心15min。16．取上清，加入等体积的氯仿，4℃，13000rpm，离心10min。17．取上清，加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇，－20℃，沉淀30min。18. 4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。19．加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。20．4℃，13000rpm，离心10min，弃上清，取沉淀。21．自然风干沉淀至无乙醇味，加入40ulddH2O充分溶解沉淀，得到双酶切载体。3．载体去磷酸化1．在40ul双酶切载体中加入以下试剂：6ul 10×buffer6ul CIAP（0.01U/ul）8ul ddH2O总体积60ul。2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀，在离心机上甩一下。3.37℃，水浴1hr。4．70℃，15min，灭活酶。5．电泳分离，胶回收双酶切载体，定量。4．载体效率检测1．按以下所示作4个连接反应： 　　DNA 连接酶 　　1 pBlueScriptII/E/X /CIAP - 检测酶切效率 2 pBlueScriptII/E/X /CIAP + 检测脱磷效率，载体自连效率 3 商品Vector加标准Insert + 对照 4 自制Vector加标准Insert + 检测载体效率 14℃连接过夜。2． 各取1ul连接产物作电转化（具体流程见电转化）3．计算克隆数，计算载体相对脱磷效率及连接效率。向左转|向右转