求大神帮助，关于我的过表达载体用pEGFPN1质粒构建转染细胞的问题

第一次接触细胞转染，有两个问题想问下贴吧里面的大神：

1、目的基因融合了gfp蛋白后对目的基因后续的功能有没有影响？因为我要做通路，目的蛋白是我检测下游基因和蛋白重要的保障。但我看了很多文献，貌似都是用的目的蛋白-gfp重组载体做的转染然后检测？所以我想问下，目的蛋白融合了gfp后会不会使得目的蛋白的功能改变或者直接失效？因为我的目的蛋白插入位点在gfp之前，如果有影响，我需不需要在目的蛋白的下游引物添加终止密码子不让gfp表达？如果按照这样做了，但是后面做转染的分组我是过表达组，空载组和空白组，过表达组没有gfp蛋白而空载组有gfp蛋白？岂不是实验不够严谨？好矛盾啊，到底转染的质粒用融合蛋白的好还是单独表达目的蛋白的号？

2、第一次在这个原代细胞上做，摸索转染效率是用gfp空载来摸索好还是用目的蛋白融合gfp质粒来摸索好？

1.据我了解的，目的蛋白融合了GFP不会使得其功能改变吧，它只是一个绿色荧光蛋白，你要是有这方面担忧的话，病毒构建包被之前就可以选择不带荧光的病毒质粒，对照组也不带。2.转染效率的摸索一个是通过GFP，可以比较直观的证明基因转入细胞，有相关的荧光图片，其实另一个也可以通过PCR、WB等这些间接证实基因转入细胞。最关键的，转染效率要结合病毒本身+细胞类型+细胞状态+操作等综合决定的，有些原代细胞本身就不好被转染，一转染死亡率很高，有些细胞需要耗费大量病毒才能转进去。

蛋白和GFP之间加个2A，它们的功能不影响

那请问楼上二位，如果我是融合gfp蛋白，在做wb的时候，是不是我的蛋白分子量要加上gfp蛋白的分子量，在切胶的时候位置要比原来目的蛋白的位置要偏大点儿？

目的蛋白基因+2A+GFP基因 这个序列插入你的载体，把载体用lipo转进细胞，它会表达2种蛋白，1是你的目的蛋白，2是GFP蛋白，二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带

jassom 目的蛋白基因+2A+GFP基因 这个序列插入你的载体，把载体用lipo转进细胞，它会表达2种蛋白，1是你的目的蛋白，2是GFP蛋白，二者是分开的。跑WB你只需目的蛋白条带加两个A，是指丙氨酸？这就能两个蛋白质分开了？需要添加IRES序列才能分开成两个蛋白质吧

是分开的。建议楼主多看看文献

楼主你做好了吗，请问楼主用的是什么试剂呀，这个【汉恒无缝克隆试剂盒】好用吗我准备用一下，不知道好不好用