【求助】慢病毒质粒构建为什么克隆辣么小

最近用plenti6载体构建慢病毒质粒，目的片段1400bp，之前转化用TOP10感受态，16小时长出的克隆比针尖大不了多少，完全不是以前大小适中、饱满的样子，如果再延长时间，原有克隆不会继续长大，而会在其周围新长出更小的一片克隆，小提酶切、测序均含有目的片段，可问题是用Qiagen中提浓度特别低，只有300,本次导入stabl3里面，还是长的针尖大小，而实验室其他人用这个载体构建的质粒，目前还都没有测序，但克隆的样子大小很正常。我不知道为什么我的克隆长的这么奇怪，那效率低是不是也跟这有关系，这个浓度完全没办法转染啊，但是操作过程没有什么问题，想请教各位大神，这是什么原因，我怎样才能提高质粒产量，谢了

lenti系列载体转化stbl3很多长出来都是小小的，大抽质粒之前先做3-4个克隆的小抽，然后选取产量较大的菌冻存。一般我5ml菌液能提出400ng/ul*35ul的质粒，400以下的就不留了，好一些的能上800ng/ul。

慢病毒载体一般都比较大。以plenti 6.3 V5 DEST来说，空载体就接近10kb. 如果利用gateway技术插入1400片段没有明显改变载体大小。但是对于仅仅含有1个细菌DNA复制起始子的载体，这个大小已经有些难以承受。这是为什么Life开发了stabl3系列菌株，以降低细菌重组频率，提高对长片段的容错能力，提高大载体在细胞内存在的稳定性。但是这并没有根本上有所改观所遇到的困难。因此，在菌落生长过程中，表现为菌落生长速度很慢。当然有些案例是，所表达的载体对细菌造成一定的毒性，影响了细菌生长。在菌落长大的过程中，有很多细菌，因为丢失了部分载体片段，因而在后期会生长出很多卫星小菌落。大多为丢失了部分载体DNA的重组子。这是为什么，在测序验证的时候，常常测不出结果。想要提高阳性菌落数量，可以针对这些问题，做些调整。比如：降低菌落培养的温度。当你使用30C 或28Ｃ进行菌落培养时候，细菌分裂生长减缓，但是带来的同时是，基因重组频率也下降了，因此，你得到的克隆阳性率会提高。此外，对于中抽或大抽，降低温度，也会减少载体DNA的突变。

展开引用mosocwj 慢病毒载体一般都比较大。以plenti 6.3 V5 DEST来说，空载体就接近10kb. 如果利用gateway技术插入1400片段没有明显改变载体大小。但是对于仅仅含有1个细菌DNA复制起始子的载体，这个大小已经有些难以承受。这是为什么Life开发了stabl3系列菌株，以降低细菌重组频率，提高对长片段的容错能力，提高大载体在细胞内存在的稳定性。但是这并没有根本上有所改观所遇到的困难。因此，在菌落生长过程中，表现为菌落生长速度很慢。当然有些案例是，所表达的载体对细菌造成一定的毒性，影响了细菌生长。在菌落长大的过程中，有很多细菌，因为丢失了部分载体片段，因而在后期会生长出很多卫星小菌落。大多为丢失了部分载体DNA的重组子。这是为什么，在测序验证的时候，常常测不出结果。想要提高阳性菌落数量，可以针对这些问题，做些调整。比如：降低菌落培养的温度。当你使用30C 或28Ｃ进行菌落培养时候，细菌分裂生长减缓，但是带来的同时是，基因重组频率也下降了，因此，你得到的克隆阳性率会提高。此外，对于中抽或大抽，降低温度，也会减少载体DNA的突变。...... 非常感谢，之前就很纠结那些卫星小菌落

kangaroo0513 lenti系列载体转化stbl3很多长出来都是小小的，大抽质粒之前先做3-4个克隆的小抽，然后选取产量较大的菌冻存。一般我5ml菌液能提出400ng/ul*35ul的质粒，400以下的就不留了，好一些的能上800ng/ul。 那你这个浓度还是蛮高的，我用stabl3转化的小提只有60-80ng/ul*60ul，现在导入DH5A，小提浓度倒是上来了，500*60，酶切验证也没问题，打算用这个了