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内部ELISA发展，清晰的高结合，平底聚苯乙烯微孔板（研发系统）覆盖了1μ克/毫升的鼠抗人孤胆枪手100μL（antigenix），0.5μ克/毫升的鼠抗人血管紧张素（研发系统），2μ克/毫升的小鼠抗人DCN（研发系统）或0.5μG /毫升兔抗人SFRP1在PBS在4°C过夜，分别，倾注所有捕获的解决方案的第二天，则四次堵塞的约束力的面积有200μL 5% BSA在PBS在25°C 1小时5% BSA在PBS溶液中去除后洗盘子，EDTA血浆和系列稀释的标准的人μMDK 100 L（antigenix），Ang（研发系统），DCN（研发系统）或SFRP1（研发系统）被加入到各孔中分别放在25°C 2H。板再PBST四次0.2μ克/毫升的生物素100μ我洗标记的兔抗人MDK（antigenix），0.4μ克/毫升的生物素标记的Ang（研发系统），0.25μ克/毫升的生物素标记的鼠抗人DC（R＆D系统）或0.2μ克/毫升的羊抗人SFRP1（研发系统）0.1%牛血清白蛋PBS是添加到每个好，分别，和25°C溶液培养删除1h后以PBST洗四次。用MDK，Ang和DCN检测，100μL 1:200稀释亲和素（研发系统）0.1% BSA在PB在每个以及培养在25°C 30分钟在黑暗中添加。对于SFRP1检测，100μL 1:2000稀释辣根过氧化物酶标记兔抗山羊免疫球蛋白（Dako公司北美国）0.1% BSA在PBS中每个以及培养在25°C 1在黑暗中添加。板和PBST和底物试剂100μ我洗了四次（研发系统）是在每个以及培养在25°C在黑暗中10分钟，加入，然后终止反应中加入2 M硫酸100μL。确定光学密度（OD450）各井立即利用集到450 nm的微孔板读者。确定如下定量限：MDK。LLOQ，0.156皮克/毫升ULOQ；，20毫微克/毫升；内CV＜6.2%，批间CV＜9.2%。昂。LLOQ，78.1皮克/毫升ULOQ；，5000皮克/毫升；内CV＜5%，批间CV＜9%。DCN。LLOQ，31.25皮克/毫升ULOQ；，2000皮克/毫升；内CV＜4.3%；批间CV＜7.8%。SFRP1。LLOQ，0.195毫微克/毫升ULOQ；，25毫微克/毫升；内CV＜4.8，批间CV＜8.8%。展开
为内部的酶联免疫吸附试验开发，明确高绑定、 平底聚-styrenemicroplates (R&D 系统) 都涂上了 1 μ g/ml 的鼠标反人类 MDK(Antigenix)，鼠标反人类 ANG (R&D 系统)，2 μ g/m l 的鼠标 antihuman DCN （R&D 系统） 或 0.5 μ g/m l 的兔抗人 sFRP1 在 PBS 在 4 ° C 0.5 μ g/m l 的 100 μ l 一夜之间，分别倾注所有的捕获解决方案，第二天和用洗板 PBST 四倍后的约束区域封锁的与 200 μ l 的 5 %bsa 在 PBS 在 25 ° C 为 1 h。5 %Bsa 在 PBS，100 μ l 的乙二胺四乙酸血浆和串行稀释标准的人类 MDK (Antigenix)、 ANG (R&D 系统)、 DCN （R&D 系统） 或 sFRP1 摘除后 (R&D 系统) 是添加到每个井分别和孵化在 25 ° C 为 2 h。板被冲走再用 PBST 四倍和 0.2 μ g/m l 的生物素共轭 100 μ l 兔抗人 MDK （Antigenix），生物素共轭山羊 antihumanANG (R&D 系统)、 生物素共轭鼠标反人类 DCN （R&D 系统） 0.25 μ g/m l 或 0.2 μ g/m l 的山羊反人类 sFRP1 0.4 μ g/m l (R&D 系统) 在 0.1%BSA inPBS 被添加到每个井分别，和孵化在 25 ° c。解决方案 wasremoved 1 h 后来由用 PBST 洗涤四次。MDK、 李安和 DCN 检测 100 μ l 1: 200 的 0.1 %bsa 在 PBS wasadded 在每个井用稀释链霉亲和-辣根过氧化物酶 (R&D 系统) 和孵化在 25 ° C 30 分钟在黑暗中。对于 sFRP1 检测，100 μ l 的瑜用 0.1 %bsa 在 PBS 是添加在每个井和孵化在 25 ° C 为 1 h 在黑暗中稀释 HRP 共轭兔抗山羊免疫球蛋白 (DAKO 北美)。板用 PBST 洗四倍和 100 μ l 底物试剂 (R&D 系统) 的在每个井加和孵化在 25 ° C 为 10 分钟，黑暗中然后通过添加 2 M 硫酸 100 μ l 终止反应。确定每个好立即通过使用酶标仪设置为 450 的光学 density(OD450) 毫微米。量化的限制被确定为 following：MDK。LLOQ，0.156 pg/ml ；ULOQ，20 吴/ml ；内部 CV<6.2%，除 CV < 9.2%。昂.LLOQ 78.1 pg/ml ；ULOQ，5,000 pg/ml ；内部 CV < 5%，除 CV < 9%。DCN。LLOQ 31.25 pg/ml ；ULOQ，2,000 pg/ml ；内部 CV < 4.3%；除 CV < 7.8%.sFRP1。LLOQ，0.195 吴/ml ；ULOQ，25 吴/ml ；内部 CV < 4.8，除 CV < 8.8%。展开
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