酵母双杂交的一些问题

问：如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？答：在有些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5个100-mm的SD/–Trp平板。在30℃下温浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml0.5XYPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中。接着就使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。问：我的诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？答：该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。这可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活。但重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

问：转化效率太低，怎么办？答：1.检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。2.DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。3.不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。4.检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1x10⁵colonies/mgDNA以上。问：杂交效率不高，该如何处理？答：在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当你对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的，新鲜的克隆进行培养。经过离心和重悬后，使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1x10⁹/ml。一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。

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